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    三步做好非洲豬瘟病毒核酸檢測試劑盒比對實驗

    日期: 2021-01-26
    瀏覽次數: 161

    三步做好非洲豬瘟病毒核酸檢測試劑盒比對實驗

    三步做好非洲豬瘟病毒核酸檢測試劑盒比對實驗

    目前生豬復養復產取得了可喜進展,生豬的存欄量不斷提高,雖然我們經歷了兩年多的“抗非防嚴峻考驗,積累了寶貴的生產實踐經驗和教訓,但是非洲豬瘟的防控依然是頭等大事。????

    非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑盒,為疫情流調、監測、溯源以及“精準清除”提供了巨大的技術支持和物質保障,試劑盒的敏感性、特異性和穩定性,是備受關注的核心問題。為此,許多養殖企業不斷開展試劑盒的比對評價實驗。

    三步做好非洲豬瘟病毒核酸檢測試劑盒比對實驗


    鑒于前期發現一些比對實驗在設計方面存在一定缺陷,因此現就有關比對實驗注意事項建議如下:



    三步做好非洲豬瘟病毒核酸檢測試劑盒比對實驗


    三步做好非洲豬瘟病毒核酸檢測試劑盒比對實驗
    第一步
    準 備
    三步做好非洲豬瘟病毒核酸檢測試劑盒比對實驗


    01

    參加比對實驗的試劑盒

    比對前,應與試劑盒生產廠家進行溝通,充分了解其產品的性能和不同的應用場景,根據自身使用需求選擇相應的試劑盒。

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    為獲得試劑盒的真實數據,應利用6~12個月的時間,從流通渠道采購相應品種不同時間生產的不同批次,每個批次3~5盒,按保存條件要求進行保存。收集足夠的試劑盒,用于后續比對實驗。

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    從流通環節采購試劑盒,比讓生產廠家直接提供,更能夠實現比對實驗的目的。

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    02

    比對實驗的操作人

    要求經驗豐富、技術水平較高的長期(一年以上)從事熒光PCR檢測工作的技術人員2~3人。

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    03

    標準品或樣品

    可以選用?

    1)病毒基因組標準物質;?

    2)質粒標準物質(含ASFV P72基因全長);

    3)假病毒標準物質;

    4)滅活的多類型的臨床樣品。

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    病毒基因組和質粒標準物質非常純凈,不含雜質,不能形成基質效應,難以評價試劑盒的耐受性和適應性,可以用于試劑盒最低檢出限的比對,驗證試劑盒中引物探針的設計和酶反應體系的擴增效率。

    三步做好非洲豬瘟病毒核酸檢測試劑盒比對實驗
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    假病毒和滅活的臨床樣品含有不同類型和濃度的雜質,存在基質效應,可以用于試劑盒的敏感性比對和最低檢出限比對。也可使用某些廠家的陽性對照質粒進行試劑盒最低檢出限的比對,但是必須確認該質粒P72基因為全長。

    三步做好非洲豬瘟病毒核酸檢測試劑盒比對實驗
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    04

    對比實驗所用的儀器

    因比對實驗反應數量較多,盡量選用96、48或32孔熒光PCR儀;實驗室所在地有大功率用電設備,應單獨為PCR儀加裝穩壓器。

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    05

    系統性驗證

    對人員、PCR儀、移液器、耗材及實驗室環境和操作規程,進行全面驗證。

    三步做好非洲豬瘟病毒核酸檢測試劑盒比對實驗
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    尤其是熒光PCR儀,選用任意一種廠家同一批次的試劑盒,用同一個中陽性樣品(Ct值30~35左右),一次性進行96、48或32全孔反應,確保每個加熱槽的加熱、降溫、擴增、信號采集性能基本一致。

    三步做好非洲豬瘟病毒核酸檢測試劑盒比對實驗
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    有條件的實驗室可選用熒光PCR校準試劑盒對PCR儀進行驗證。一旦出現異常情況應進行排查,確保后續的比對實驗完全可控。

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    第二步
    檢 測
    三步做好非洲豬瘟病毒核酸檢測試劑盒比對實驗


    01

    最低檢出限比對

    采用質粒、病毒基因組標準物質或者假病毒標準物質,首先進行10倍系列稀釋,制備3~5梯度,最高稀釋度為每個PCR反應加樣量含10拷貝左右的靶序列,即配即用。然后對所保存各廠家3個以上批次的成品試劑盒進行比對,每個稀釋梯度,至少重復3~8個反應。

    三步做好非洲豬瘟病毒核酸檢測試劑盒比對實驗
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    一般情況下其Ct值超過35時,應統計出現Ct的反應數即檢出率,進行比較。同樣的樣品,先比較檢出率,再比較平均Ct值;檢出率越高,平均Ct值越小,最低檢出限越低,檢測的靈敏度就越高。

    三步做好非洲豬瘟病毒核酸檢測試劑盒比對實驗
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    02

    敏感性比對

    采用假病毒或多類型的臨床樣品。假病毒可以進行10倍系列稀釋,來源充足,溶液均一,質量穩定可控,即配即用。使用臨床樣品時,應將不同來源的樣品如唾液、血液、血清、糞便、組織勻漿液等,滅活后按類型進行合并、混勻、離心取上清液,確保每一類樣品濃度均一,體積數量應超過5ml。

    三步做好非洲豬瘟病毒核酸檢測試劑盒比對實驗
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    先用任一種試劑盒,對不同類型的臨床樣品進行初步檢測,確保各類型樣品的Ct值分布在30~40之間,然后進行分裝,冷凍保存。使用時,用一支,取一支,棄一支,避免反復凍融,避免長時間冷藏保存,造成實驗誤差,不能完全反應試劑盒的性能。

    三步做好非洲豬瘟病毒核酸檢測試劑盒比對實驗
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    統一采用同一種方法,磁珠法或離心柱式提取后的樣品核酸,對所保存同一廠3個以上批次的成品試劑盒進行比對,每個樣品重復3~8反應,必要時可做20個反應。????

    三步做好非洲豬瘟病毒核酸檢測試劑盒比對實驗
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    一般情況下Ct值超過35的樣品,統計出現Ct的反應數即檢出率,進行比較。同樣的樣品,先比較檢出率,再比較檢測平均Ct值;檢出率越高,Ct值越小,試劑盒的敏感性越強。

    三步做好非洲豬瘟病毒核酸檢測試劑盒比對實驗
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    03

    穩定性比對

    對不同廠家的各個批試劑盒的最低檢出限比對實驗中各濃度樣品的檢測數據、敏感性比對實驗中各樣品的檢測數據進行分類統計分析。

    三步做好非洲豬瘟病毒核酸檢測試劑盒比對實驗
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    計算同一樣品用不同批次試劑盒檢測Ct值之間的變異系數;計算不同樣品不同批次試劑盒檢測數據之間的總變異系數。變異系數越小,試劑盒的批間差異越小,性能越穩定。

    三步做好非洲豬瘟病毒核酸檢測試劑盒比對實驗
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    04

    例外提醒

    極個別廠家的試劑盒設計的反應程序,不是從第一個循環開始收集熒光信號,計算Ct值時顯著低于主流設計試劑盒,此類試劑盒的Ct值沒有可比性,僅比較檢出率。

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    第三步
    分 析
    三步做好非洲豬瘟病毒核酸檢測試劑盒比對實驗


    01

    最低檢出限

    標準物質系列稀釋后,對同一樣品檢出的稀釋倍數越大,相同稀釋倍數的檢出率越高,平均Ct值越小,則該試劑盒的最低檢出限越低,檢測靈敏度越高。

    三步做好非洲豬瘟病毒核酸檢測試劑盒比對實驗
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    某種試劑盒的3個批次對假病毒標準物質(特定濃度)的3個稀釋度20000、40000、80000倍,各進行20個反應的檢出率和檢測平均Ct值。

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    三步做好非洲豬瘟病毒核酸檢測試劑盒比對實驗

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    第一批

    對20000倍檢出率95%,平均Ct值為37.56,

    對40000倍檢出率85%,平均Ct值為38.47;

    對80000倍檢出率60%,平均Ct值為38.67。





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    第二批

    ?對20000倍檢出率100%,平均Ct值為37.78,

    對40000倍檢出率80%,平均Ct值為38.28;

    對80000倍檢出率70%,平均Ct值為38.57。





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    第三批

    對20000倍檢出率95%,平均Ct值為37.06,

    對40000倍檢出率90%,平均Ct值為37.56;

    對80000倍檢出率50%,平均Ct值為38.54。

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    02

    敏感性實驗數據分析

    敏感性實驗數據分析分析各廠家試劑盒不同批次間的穩定性時,可對同樣的臨床樣品或者標準物質,不同批次間的檢測Ct值應計算變異系數即CV值。


    CV值一般情況下應小于5%,甚至可以小于2%,數據越小,批次間的差異越小,試劑盒的質量越穩定。

    三步做好非洲豬瘟病毒核酸檢測試劑盒比對實驗




    某種試劑盒連續14個批次留樣,2人用3個樣品、同一臺熒光PCR儀進行的批間差異檢驗。分別按人、按樣品進行批間變異系數分析,結果14批試劑盒:

    對樣品ASFV/B1/1檢測平均Ct值為29.71,CV值為1.24%;

    對樣品ASFV/B1/2檢測平均Ct值為32.28,CV值為1.15%;

    對樣品ASFV/B1/3檢測平均Ct值為35.46,CV值為1.70%。

    14批試劑盒對3個樣品的2人實驗,批間變異系數均小于2%,表明試劑盒穩定性極高。

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    14個批次試劑盒2人3樣品熒光PCR擴增曲線圖和Ct值分布圖

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    友情提示:

    1、鑒于生產實踐中的客觀條件和適用性,刪減了相對嚴謹的要求,簡化了部分環節;對于CNAS認可實驗室的設計,應進一步補充相關要求。

    2、鑒于生產實踐要求,本文未設計特異性實驗比對。

    3、其他類型的核酸檢測試劑盒的最低檢出限、敏感性和穩定性比對實驗設計可以參考本方案。

    三步做好非洲豬瘟病毒核酸檢測試劑盒比對實驗

    END

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